Kota Ambarawa sejak zaman Hindia Belanda merupakan daerah militer, sehingga Raja Willem I berkeinginan untuk mendirikan bangunan stasiun kereta api guna mengangkut pasukannya menuju Semarang. Maka pada tahun 1873 dibangun Stasiun Kereta Api Ambarawa dengan luas tanah 127.500 m2 Stasiun Kereta Api Ambarawa dihentikan pengoprasiannya dan pada tanggal 8 April 1976 Gubernur Jawa Tengah Soepardjo Rustam bersama Kepala PJKA Eksploatasi Soeharso memutuskan Stasiun Ambarawa dijadikan Museum Kereta Api. 

Koleksinya terdiri dari berbagai lokomotif yang berjumlah 26 buah, perlengkapan perkeretaapian seperti sinyal, wesel, telepon dan telegraf. Lokomotif yang paling tua buatan tahun 1891 Tipe C.1140, dan yang termuda buatan tahun 1928 tipe C.5029.

Disamping itu juga dilengkapi dengan kereta api atau lokomotif uap 8.2503 dengan tiga buah kereta atau gerbong yang masih bisa berjalan menaiki bukit dengan re i bergigi, yang dikenal dengan sebutan “Kereta Api bergigi’.